近日，浙大儿院骨科团队联合浙江大学欧阳宏伟教授团队在Advanced Science上发表了题为Hyperplastic Human Macromass Cartilage for Joint Regeneration的研究论文，通过在培养体系中程序化引入特定的生长发育信号，有效调控人类软骨细胞的增殖和再生潜能，在没有生物材料支架参与的体外环境中，生产出直径达3.25毫米的均质软骨组织，兼顾质量的同时超越了目前常见尺寸（1.5 毫米直径），为治疗关节软骨损伤提供了一种优质的即用型移植物，也为软骨再生提供了新策略和新技术。

 

   原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202301833

 

   该文通讯作者为浙江大学欧阳宏伟教授，共同通讯作者为浙江大学医学院附属儿童医院骨科副主任陈建松。第一作者为浙江大学医学院2018级博士文雅，共同第一作者为浙江大学爱丁堡大学联合学院（ZJE）博士后陈奕姗和浙江大学医学院附属儿童医院骨科副主任医师吴伟良。该研究得到了国家自然科学基金（T2121004，31830029，82002319）的资助。

 

关节软骨再生策略有待优化

 

  关节软骨是一种位于关节表面的结缔组织，在关节运动中发挥着润滑和缓冲的重要功能，但这种功能却会随着关节软骨损伤的发生和恶化而逐渐丧失，使患者遭受关节疼痛、活动受限，乃至残疾。因此，关节软骨损伤的修复再生，是运动医学的一项重要任务。移植高可塑性的软骨组织块是一种新兴的再生疗法，相比于临床常用的自体软骨细胞植入术，程序简单、创伤更少。但目前其制造技术尚无法满足临床移植需要的数量和质量。

 

成年人类关节软骨主要由富含糖胺聚糖和胶原蛋白的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）构成，软骨细胞占比不足5%并且再生潜能十分有限，如果缺少适当的治疗，意外造成的软骨损伤可能发展为骨关节炎，对超过16%的成年人的健康和生活造成严重影响。

自体软骨细胞移植术通过在缺损处植入患者自身的健康软骨细胞，形成修复组织填补缺损，从而减轻患者症状，被誉为软骨早期损伤的“黄金疗法”。然而，该疗法的效果取决于患者自体细胞的再生能力，更加适用于年轻患者。此外，移植的细胞需要从患者自身获取，这一过程会造成创伤，增加患者的痛苦以及术后护理的难度。

相比之下，移植高可塑性的软骨组织块是一种更加方便、可行的治疗方法。工程软骨组织是一种模拟天然组织的三维（three-dimensional，3D）细胞培养物，得益于软骨环境的免疫“特权”，可以采用同种异体的种子细胞，因此也适用于老年患者，具备通用性；此外，这种组织作为现成可用的移植物，只需要对患者进行单次手术，使治疗程序更加简单。

遗憾的是，当前策略所制造的无支架软骨组织还无法同时满足临床治疗的数量和质量需求。其主要挑战在于：首先，可用于构建组织的种子细胞数量有限；其次，在体外培养过程中，组织无法同时维持体积增长和表型维持，当直径大于1.5毫米时， ECM质量往往下降，并出现坏死的核心。

 

定制化培养激活细胞潜能，

高效再生无支架的软骨组织

针对这些挑战，课题组采取的策略是选择来源稳定的、再生潜力强的幼稚软骨细胞，并通过建立两阶段的特定无血清培养条件（customized culture conditions，CC），引入生长发育相关信号，放大细胞潜能，从而实现无支架软骨组织的高效体外再生。

CC组中，软骨细胞聚集形成了具有完整结构的3D致密盘状组织，该组织的直径随时间增长，可达到 3.25 毫米左右，且沉积了大量且均匀的透明样软骨ECM（图1）。相比之下，相同的种子细胞在经典的含血清培养扩增后，再无血清条件分化培养（typical serum-containing culture conditions，TC），只能形成直径更小、结构中空的环状组织，且ECM分布存在明显的区域异质性。

图1 定制化体系诱导大尺寸均质软骨组织的高效再生

那么，这种兼具大尺寸和高质量的均质软骨组织（macro-cartilage）是如何产生的呢？课题组对培养过程中的组织进行了转录组测序分析，发现在CC培养的第一阶段中，细胞活动以增殖为主，引起了组织的体积增长，在第二阶段中则以软骨分化为主，累积了丰富的典型软骨ECM（图2）。在培养过程的重要转折点——第一阶段末期（CC-S1）时，细胞发生了“去分化”，短暂地丢失了功能表型，同时，还具备增殖和代谢活性增强、炎症水平被抑制的特征。基于这些特征及前人研究基础，团队将CC-S1命名为中间可塑性阶段（可塑性是指细胞具有改变命运或表型的能力），它允许细胞重新进入细胞周期，增殖活跃的同时经历去分化，随后发生再分化，从而实现数目和功能的兼得。因此，细胞可塑性的激活，被认为是驱动macro-cartilage高效再生的主要因素。

 

图2 中间可塑性的激活驱动macro-cartilage高效再生

 最后，为了证明macro-cartilage的临床应用价值，课题组将其植入到关节软骨缺损的动物模型中。实验结果表明， macro-cartilage能够在关节环境中维持其丰富且均匀的软骨ECM，并且显著促进了缺损的修复（图3），相比于TC培养的组织，组织学评分提高了33.71%，显示出更优的治疗效果。

 

图3 macro-cartilage在体内维持功能表型并修复关节软骨缺损

 综上所述，针对软骨再生困难的问题，课题组通过研究软骨细胞体外扩增和分化的调控手段，充分激发幼稚软骨细胞的可塑性潜能，诱导细胞在无支架的体外环境下再生出兼具扩增性和功能表型的软骨组织，为了软骨修复提供了一种大尺寸、高质量的均质移植物。本研究的主要意义在于为广大的软骨损伤患者提供了简单、高效的软骨移植物，另一方面，通过调控细胞固有潜能加速组织再生，为再生医学工程技术的创新提供了新见解。